Вверх
ООО Биотехагро Карта сайта Поиск по сайту
Биотехагро - производство биопрепаратов для сельского хозяйства Внимание! 60 гр «Бацелла-М» увеличивают на 1,5-2 кг среднесуточный надой от коровы. Сегодня молоко в цене!
<<< Опыты — Птицеводство

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
УРАЛЬСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации.



Утверждено
Проректор по научной работе
доктор медицинских наук, профессор
О.П. Ковтун
Научный руководитель
доктор медицинских наук, профессор
О.Г. Макеев

Екатеринбург 2009г.

Отчет
о научно-исследовательской работе
Создание линии культивируемых клеток эмбриона курицы.
Исследование эффектов пробиотика (Моноспорин) и антибиотика (Энроколи), используемых в технологических схемах выращивания молодняка, на культивируемой линии клеток эмбриона курицы.

(заключительный)

Введение

Технология интенсивного птицеводства предполагает содержание большого поголовья птицы на ограниченных площадях. Последнее сопряжено с угрозой возникновения и быстрого распространения инфекционных заболеваний и массового падежа птиц. Основная причина гибели — желудочно-кишечные заболевания (свыше 50% от общего падежа) [2, 5].

В настоящее время одним из путей профилактики желудочно-кишечных заболеваний является добавление в корм антибиотиков широкого спектра действия и (или) пробиотиков — культур непатогенных микроорганизмов, тем или иным способом подавляющих рост патогенной флоры. [1, 4, 6, 8].

Одним из пробиотиков, хорошо зарекомендовавших себя в птицеводстве, являются пробиотики на основе В.Subtilis [9, 10, 11, 12].

Последние, наряду с низкой токсичностью, эффективно защищают молодняк от широкого спектра патогенных микроорганизмов путем синтеза разнообразных бактерицидных веществ и, наряду с этим, образуют большое количество факторов, обеспечивающих интенсивный рост и развитие цыплят.

Вместе с тем, применение данного пробиотика не гарантирует защиту от массированного поступления патогенных микроорганизмов в современных условиях птицеводства и тем более в условиях трансовариального заражения цыплят. Это диктует необходимость применения антибиотиков широкого спектра действия, в частности ЭНРОКОЛИ. Данный препарат представляет собой комбинацию двух антибиотиков с различным механизмом действия — энфрофлоксицина — препарата фторхинолинового ряда и колистина — продукта жизнедеятельности B.Polymyxa, нарушающего проницаемость бактериальной стенки. Среди ряда современных антибиотиков, применяющихся в ветеринарии, Энроколи является наиболее эффективным по показателю соотношения токсичность/бактерицидность [2, 5]. Вместе с тем, в настоящее время Энроколи постепенно утрачивает свою эффективность по мере развития устойчивости патогенных микроорганизмов к энфрофлоксицину. Последнее обусловлено сложностью дозирования препарата в условиях промышленного птицеводства. Кроме того, компоненты антибиотика высоко токсичны для человека, [15], что обуславливает запрет на использование для пищевых целей продуктов птицеводства ранее, чем через 9 суток после окончания применения данного препарата, что создает условия для массового инфицирования птицы в данный временной промежуток [13].

В связи с этим, с целью эффективной профилактики инфекционной патологии у птиц в условиях современного птицеводства наиболее перспективным является комбинирование анти- и пробиотиков. Однако данные об исследованиях подобного рода в доступной литературе практически отсутствуют.

Ранее в подобных работах традиционно использовались модельные эксперименты на животных. В тоже время, наиболее отвечающим современным требованиям является метод культуры клеток. Главное преимущество применения метода — возможность прижизненного наблюдения клеточного метаболизма. Так же существенно, что при работе с культурами клеток в эксперименте используются кондиционированные клетки, сохраняющие жизнеспособность в течение всего эксперимента. Генетическая однородность популяции клеток, постоянство условий их роста позволяют оценивать влияние на рост клеток самых различных факторов — рН, температуры, концентрации аминокислот, витаминов, антропоэкологических факторов с оценкой роста культуры в течение любого периода времени. Приведенные преимущества культуральных методов в сравнении с исследованиями in vivo, дают основания для предпочтения применения клеточных культур в качестве экспериментальной модели.

В связи с изложенным, в настоящей работе было исследовано влияние антибиотика Энроколи и факторов, секретируемых В.Subtilis, на модели ранее полученной линии эмбриональных клеток курицы.

Материалы и методы исследования

Культивирование В.Subtilis.

Культура любых эмбриональных клеток, в том числе эмбриональных клеток курицы (ЭКК), весьма чувствительна к составу среды инкубации. Для нивелирования эффектов транспортной среды, В.Subtilis, на предварительном этапе было выполнен пересев В.Subtilis на среду, используемую для выращивания ЭКК.

С этой целью из предоставленного Заказчиком препарата, содержащего В.Subtilis, после интенсивного встряхивания были отобраны пробы объемом 10мл, которые затем были отцентрифугированы. Супернанат был отброшен, а к осадку добавлен буферный раствор, в котором бактерии были ресуспендированы и вновь отцентрифугированы при тех же условиях. Данный этап повторяли трижды.

По завершении отмывки, осадок вновь ресуспендировали и, с целью контроля жизнеспособности В.Subtilis, часть взвеси высевали на Agar L3147 (рис.1), другую часть помещали в среду, содержащую D-МЕМ (Sigma), Ham’s F-10 (MP Biomedicals) и фетальную бычью сыворотку степени очистки defined (HyClone, США).

Рис 1. Рост выделенных культур B.Subtilis.
Нативный препарат.

Рост выделенных культур <em>B.Subtilis</em>. Нативный препарат.

Через 3 часа культивирования (фаза интенсивного роста) образцы центрифугировали.

С целью оценки адекватности культуральной среды, часть культуры наносили на предметное стекло, фиксировали метанолом, окрашивали по Граму и микроскопировали (рис 2).

Рис. 2. Рост B.Subtilis в среде, состоящей из D-МЕМ, Ham’s F-10, и FBS.
Окраска по Граму.

Рост <em>B.Subtilis</em> в среде, состоящей из D-МЕМ, Ham’s F-10, и FBS. Окраска по Граму

Супернатант, содержащий факторы, выделяемые В.Subtilis, стерилизовали путем фильтрации через ацетат-целлюлозный фильтр Sarstedt, Германия) и использовали в дальнейшем для изучения влияния продуктов жизнедеятельности В.Subtilis на рост и развитие ЭКК.

Культивирование эмбриональных клеток куриц.

Культивирование ранее выделенных и замороженных ЭКК проводили в инкубаторе Sanyo (Япония). Культуральную среду меняли 1 раз в 3 дня. Ежедневно производили микроскопический контроль за состоянием культуры с использованием инверсионной микроскопии (рис 3).


Рис 3. Культура ЭКК, увеличение х400

Рис 3. Культура ЭКК, ув 400х

Оценка влияния продуктов В.Subtilis

Для оценки влияния продуктов, синтезируемых В.Subtilis во время роста, ЭКК инкубировали в стандартной среде с добавлением стерилизованного супернатанта культуры роста В.Subtilis в соотношении 1/99, 10/90, 20/80, 30/70 (первая цифра — объем супернатанта культуры роста В.Subtilis, вторая — объем культуры ЭКК).

С целью изучения влияния антибиотика с торговой маркой «Энроколи» (SL España), последний добавляли в среду инкубации ЭКК в количестве 0,1, 0,25, 2,5 и 25мкг/мл среды.

Совместное влияние изучаемых препаратов исследовали посредством внесения в культуральную в среду ЭКК вносили обоих препаратов по схеме, представленной в таблице и проводили сравнение с показателями контрольной культуры (без добавления данных веществ).

Соотношение объемов супенантанта B.Subtilis и среды инкубации ЭМК/ Концентрация антибиотика (мкг/мл) 0,1 0,25 2,5 25
1/99 Оцениваемый параметр Оцениваемый параметр Оцениваемый параметр Оцениваемый параметр
10/90 Оцениваемый параметр Оцениваемый параметр Оцениваемый параметр Оцениваемый параметр
20/80 Оцениваемый параметр Оцениваемый параметр Оцениваемый параметр Оцениваемый параметр
30/70 Оцениваемый параметр Оцениваемый параметр Оцениваемый параметр Оцениваемый параметр

Подсчет клеток производили на гематологическом анализаторе. После подсчета взвесь клеток заливали в вентилируемые культуральные матрасы (Sarstedt, Германия) и помещали в СО2-инкубатор. Дальнейшее культивирование проводили при тех же условиях (смена среды, визуальный контроль) с пассажами клеток на матрасы, имеющие большую площадь. Культуру ЭКК выращивали до получения требуемой клеточной массы. По завершении культивирования клетки трипсинизировали, отмывали и использовали для исследования.

Синтетическую активность ЭКК оценивали по включению в макромолекулы меченых селективных предшественников синтеза ДНК (214С-тимидин), РНК (14С-уридин) и белка (3Н-лейцин).

Радионуклиды вносили на матрасы одновременно с ЭКК из вторичной 6-ти суточной культуры. Эксперимент прерывали через трое суток культивирования, клетки снимали с матрасов раствором трипсина-версена (Sigma) по стандартной методике и подсчитывали на гематологическом анализаторе. Подсчет радиоактивности производили в спиртотолуоловом сцинтилляторе на жидкостном сцинтилляционном счетчике Бета-2. Результаты выражали в беккерелях на 106 клеток.

Статистическая обработка проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 3.04. Результаты считали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Внесение в культуру ЭКК среды, содержащей продукты жизнедеятельности B.Subtilis, сопровождается статистически достоверным изменением активности клеток в отношении синтеза ДНК (табл.№1, рис.4), причем в интервале соотношения объемов культур 1/99 — 20/80 наблюдается стимуляция синтеза ДНК (до 38,89%). Дальнейшее увеличение концентрации продуктов жизнедеятельности бактерий вызывает достоверное угнетение синтеза ДНК (на 11%).

Вероятно, последнее связано с образованием B.Subtilis веществ, обладающих способностью угнетать пролиферацию не только микроорганизмов, но и ЭКК. Однако данный эффект проявляется лишь при замещении среды инкубации ЭКК средой кондиционированной B.Subtilis на треть по объему.

Таблица 1 — Влияние продуктов жизнедеятельности B.Subtilis и антибиотика Энроколи на включение 214С-тимидина в ДНК эмбриональных клеток курицы в условиях культуры.

Включение 214С-тимидина в ДНК (Бк/106кл) Концентрация антибиотика, мкг/мл
Соотношение объемов сред инкубации (v/v)   0 0,1 0,25 2,5 25
0 5,4±0,09 4,36±0,07* 4,73±0,08* 1,25±0,04* 0,33±0,02*
1/99 6,7±0,11* 4,81±0,04*# 4,29±0,12* 1,48±0,11* 0,47±0,03*#
10/90 7,9±0,11* 5,62±0,13# 4,64±0,07* 1,64±0,05*# 0,32±0,06*
20/80 7,5±0,12* 4,31±0,07* 4,12±0,05*# 1,16±0,05* 0,33±0,07*
30/70 4,8±0,04* 4,27±0,27* 4,53±0,08* 1,13±0,10* 0,28±0,04*

Примечание * — достоверное отличие от контроля (без добавления среды роста B.Subtilis и антибиотика.
# — достоверное отличие включения 214С-тимидина в ДНК в культуре с добавлением среды роста B.Subtilis и антибиотика от культуры только с добавлением антибиотика в соответствующей концентрации.

Здесь и далее достоверным считали отличие при р<0,05.

Рис. 4. Динамика изменения синтеза ДНК под влиянием продуктов жизнедеятельности B.Subtilis и антибиотика.
Данные представлены в процентах от контроля.

Динамика изменения синтеза ДНК под влиянием продуктов жизнедеятельности B.Subtilis и антибиотика.

Следует отметить, что угнетение синтеза ДНК при добавлении значительного объема кондиционной среды B.Subtilis не может быть объяснено возникающим вследствие разведения дефицитом факторов роста ЭКК, поскольку бактерии инкубировали в среде идентичной по составу среде культивирования ЭКК.

Внесение в культуру ЭКК антибиотика Энроколи в диапазоне концентраций 0,1–25мкг/мл вызывает стойкое угнетение включения селективной метки в ДНК (на 20% уже при концентрации 0,1мкг/мл и на 93,89% — в максимальной концентрации). Последнее можно объяснить присутствием в составе Энроколи энфрофлоксицина — препарата фторхинолинового ряда, механизм действия которого заключается в ингибировании синтеза ДНК.

Привнесение в среду продуктов роста бактерий, обладающих стимулирующим эффектом в отношении синтеза ДНК, несколько улучшает ситуацию. Так, при концентрации антибиотика 0,1мкг/мл применение кондиционированной среды B.Subtilis в соотношении 10/90 угнетения синтеза ДНК не наблюдалось (данные не отличались от контроля). Однако при остальных концентрациях угнетающий эффект антибиотика сохранялся, хотя и был выражен в меньшей степени. Вероятно, синтезируемые бактериями вещества способны либо реактивировать топоизомеразы, блокируемые фторхинолинами, либо бактерии синтезируют вещества, способные «расплетать» двойную цепочку ДНК, оказывая топоизомеразоподобный эффект [16]. По крайней мере, феномен устойчивости к антибиотикам данного ряда рассматривается в настоящее время как многостадийный процесс, включающий в себя, помимо перечисленных, снижение поступления антибиотика внутрь клетки и его ускоренную внутриклеточную деградацию [14].

Анализ данных влияния изучаемых веществ на включение радиоактивно меченого предшественника синтеза РНК 14С-уридина продемонстрировал в целом сходную картину (таб.№ 2, рис. 6) с той лишь разницей, что выявленные на примере синтеза клетками ДНК эффекты были более выраженными. Так, продукты жизнедеятельности бактерий вызывали увеличение синтеза РНК на 50–80%, а в максимальной концентрации не оказывали ингибирующего эффекта. Более того, наблюдалась некоторая тенденция к стимуляции (на 33%), однако отличие от контроля оказалось недостоверным. Возможно последнее обусловлено тем, что B.Subtilis активно продуцирует инозин. Эта особенность бактерий применяется для производства последнего в промышленных целях [3].

В тоже время хорошо известно, что анаболический эффект инозина обусловлен его участием в синтезе РНК, а так же тем, что инозин является кофактором транскрипции [7].

Таблица 2 — Влияние продуктов жизнедеятельности B.Subtilis и антибиотика Энроколи на включение 14С-уридина в РНК эмбриональных клеток курицы в условиях культуры.

Включение 14С-уридина в РНК (Бк/106кл) Концентрация антибиотика мкг/мл
Соотношение объемов сред инкубации (v/v)   0 0,1 0,25 2,5 25
0 21,44±1,05 11,31±0,13* 5,23±0,20* 4,11±0,19* 4,33±0,17*
1/99 32,65±1,08* 22,89±0,97# 18,55±0,69# 13,72±0,80# 9,11±0,57#
10/90 39,61±0,99* 21,51±0,73# 23,40±1,11# 18,74±1,12# 10,23±0,63#
20/80 35,64±1,20* 23,52±0,24# 21,79±0,74# 22,46±0,88# 13,47±0,08#
30/70 28,64±0,91 20,49±0,15# 21,11±0,42# 20,64±1,30# 16,7±0,73*#

Примечание * - достоверное отличие от контроля (без добавления среды роста B.Subtilis и антибиотика).
# - достоверное отличие включения 14С-уридина в РНК в культуре с добавлением среды роста B.Subtilis и антибиотика от культуры только с добавлением антибиотика в соответствующей концентрации.

Таблица 3 — Влияние продуктов жизнедеятельности B.Subtilis и антибиотика Энроколи на включение 3Н-лейцина в белок эмбриональных клеток курицы в условиях культуры.

Включение 3Н-лейцина в белок (Бк/106кл) Концентрация антибиотика
Соотношение объемов сред инкубации (v/v)   0 0,1 0,25 2,5 25
0 66,56± 2,33 41,34±1,75* 30,12±1,35* 24,11±0,97* 14,33±0,53*
1/99 89,23±2,46* 68,96±2,03# 42,42±2,31*# 37,09±1,25*# 21,64±0,12*#
10/90 102,22±3,61* 70,58±2,34# 63,66±2,07# 35,94±1,24*# 22,88±0,09*#
20/80 89,87±2,89* 67,22±1,33# 58,97±3,31*# 32,83±1,97*# 19,64±0,07*#
30/70 77,88±2,01 53,11±1,00*# 28,53±0,83*# 33,96±1,45*# 15,46±0,99*

Рис 5. Динамика изменения синтеза РНК под влиянием продуктов жизнедеятельности B.Subtilis и антибиотика. Данные представлены в процентах от контроля.

Динамика изменения синтеза РНК под влиянием продуктов жизнедеятельности<em> B.Subtilis</em> и антибиотика.

Поскольку механизм действия исследуемого антибиотика по-видимому заключается в блокировании топоизомераз, то наряду с нарушением репликации ДНК так же будет наблюдаться и нарушение транскрипции. Полученные данные в полной мере соответствуют этому предположению. Так, добавление антибиотика в культуральную среду сопровождалось дозозависимым подавлением синтеза РНК на 47–87%%.

Как и в исследовании синтеза ДНК, привнесение продуктов жизнедеятельности бактерий в культуру ЭКК с добавлением антибиотика лишь в некоторой степени улучшало картину. Анализ данных, полученных при изучении эффектов продуктов B.Subtilis и антибиотика Энриколи на синтез эмбриональными клетками курицы белка позволил установить, что тенденция, выявленная в отношении синтеза нуклеиновых кислот, в целом сохраняется.

Продукты жизнедеятельности B.Subtilis в зависимости от концентрации, оказывают стимулирующий эффект на синтез белка ЭКК (табл.3, рис. 6).

Рис 6. Динамика изменения синтеза белка под влиянием продуктов жизнедеятельности B. Subtilis и антибиотика. Данные представлены в процентах от контроля.

Динамика изменения синтеза белка под влиянием продуктов жизнедеятельности <em>B. Subtilis</em> и антибиотика.

Вместе с тем, выявленная зависимость не является линейной. Так, в диапазоне соотношения объемов кондиционная B.Subtilis культура/культура ЭКК 1/99, 10/99 наблюдается рост стимулирующего эффекта продуктов жизнедеятельности B.Subtilis в отношении включения меченого лейцина в белок (на 34 и 54%% по сравнению с контрольными величинами соответственно). В диапазоне соотношения объемов 20/80 и 90/80 наблюдается снижение стимулирующего эффекта (до 17%).

Следует отметить, что зарегистрированная стимуляция синтеза белка не может быть объяснена образованием бактериями аминокислот, так как среда ДМЕМ содержит их в избыточном количестве.

При добавлении в культуру инкубации антибиотика Энроколи выявлено дозозависимое снижение синтеза белка клетками (от 38% при минимальной концентрации до 78% при максимальной концентрации антибиотика).

Применение продуктов жизнедеятельности B.Subtilis в ряде случаев позволяет предотвратить угнетение синтеза белка под влиянием антибиотика, но лишь при его минимальных (0,1 и 1мкг/мл) концентрациях в среде.

Выводы:

1. Впервые на модели эмбриональных клеток курицы показано, что B.Subtilis, являющейся основой препарата Моноспорин, обладает способностью непосредственно влиять на основные синтетические внутриклеточные процессы.

2. Выявленная зависимость «доза — эффект» не является линейной. Во всех случаях малые и средние дозы оказывают стимулирующий эффект, в то время как значительные концентрации продуктов пробиотика оказывают либо ингибирующий (в отношении синтеза ДНК), либо незначительный стимулирующий эффект (синтез РНК и белка).

3. Полученные результаты дают основания предполагать, что среди продуктов жизнедеятельности бактерий, входящих в состав пробиотика Моноспорин, присутствуют вещества, оказывающие угнетающий эффект на анаболические процессы в клетках.

4. Антибиотик ЭНРОКОЛИ оказывает дозозависимый угнетающий эффект на синтетические параметры эмбриональных клеток. Зависимость является линейной. Величина эффекта прямо пропорциональна дозе.

5. Использование продуктов жизнедеятельности B.Subtilis на фоне применения антибиотика ЭНРОКОЛИ в ряде случаев позволяет скорректировать его ингибирующий эффект, при условии минимальной концетрации антибиотика в среде.

Динамика изменения синтеза белка под влиянием продуктов жизнедеятельности <em>B. Subtilis</em> и антибиотика. Динамика изменения синтеза белка под влиянием продуктов жизнедеятельности <em>B. Subtilis</em> и антибиотика.